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2021/05/25

【TriLink】研究新知 – 蛋白連結酶介導的胞外體表面功能化工程學之優勢



胞外體（Extracellular vesicles, EVs）是由細胞衍生出的膜狀顆粒，可轉移蛋白質和核酸來傳遞細胞間的訊號。由於胞外體不僅能夠輕易穿過細胞壁壘，而且在循環過程中也很穩定，因此，近年來常被用作藥物輸送的工具。將胞外體導向特定細胞類型的一種方法是將targeting ligands附著在胞外體表面。然而，當前的胞外體工程學方法不但費力且效率低，突顯了對替代方法的需求。Pham等人在《Journal of Extracellular Vesicles》上發表了一篇文獻，使用蛋白連接酶將targeting ligands與胞外體共價連接，並報導了該方法可有效地將治療性分子遞送至癌細胞。

酶介導的胞外體表面功能化具有許多優勢
迄今為止，生產針對特定細胞類型的胞外體最常用的方法之一是在胞外體供應細胞中表達targeting ligand（通常與胞外體膜蛋白融合，例如Lamb2b或CD63），並按比例放大胞外體以進行純化。這樣的方法既耗時又昂貴，因為需要多個步驟：cloning、轉染或病毒轉導、細胞篩選、大規模細胞培養和胞外體純化。有一種替代方法是先將胞外體分離出來，之後使用化學或基於親和力的方法在胞外體上包覆targeting ligands。然而，化學處理的苛刻性可能導致功能喪失，而親和力結合常常是短暫且不穩定的。
 
酶介導的胞外體表面功能化具有幾個重要的好處。此方法不僅消除了對病毒轉導和細胞增殖的需求，從而縮短了時間表，而且使用溫和的反應條件來保護胞外體（通常在中性pH下進行反應）。此外，酶介導的表面功能化是具再現性且可控的，並且可以大規模產生穩定、經共價修飾的胞外體。由於這些原因，有機會成為細胞特異性遞送藥物的首選方法。


靶向癌細胞方面的實用性
在鑑定出人類紅血球細胞胞外體（RBCEV）作為有希望的藥物輸送候選者後，Pham等人將帶有EGFR靶向位點的生物素化胜肽或EGFR納米抗體接合到紅血球細胞胞外體，接合反應是由蛋白連接酶Sortase A或OaAEP1催化的，以穿透式電子顯微鏡（TEM）對有包覆/沒包覆的紅血球細胞胞外體進行分析，結果顯示胜肽接合不影響胞外體的結構與完整性。
 

 
經過詳細的表徵比較，發現Sortase A連接酶比起OaAEP1能更有效地將胜肽接合到胞外體表面。將表面有修飾和沒修飾的紅血球細胞胞外體分別裝入mRNAs（包括TriLink的CleanCap®FLuc mRNA）或化療藥物（包括Paclitaxel），然後用於培養中的細胞以比較對細胞的影響。

胞外體進行酶介導的表面功能化後，增強了對目標細胞的遞送。例如，使用α-EGFR-VHH-RBCEVs將螢光素酶mRNA遞送至H358細胞，與未進行表面功能化的RBCEVs相比，螢光素酶活性提高了100％。表面功能化的紅血球細胞胞外體也增強了低劑量化療藥物Paclitaxel對EGFR陽性癌細胞的功效，這一發現最終可能等同於降低劑量並減少有害副作用。
 
 

原始文章請見>> Benefits of Enzyme-Mediated Extracellular Vesicle Engineering

*Reference：J Extracell Vesicles. 2021 Feb;10(4):e12057. doi: 10.1002/jev2.12057. Epub 2021 Feb 16. 
 

TriLink mRNA


正確的mRNA Cap對於產生最高生物活性和最小的免疫原性mRNA至關重要。TriLink科學家開發了CleanCap®新一代加帽(Capping)技術，用於解決mCAP/ARCA加帽效率低或酵素Capping成本高的問題。
 
  • Capping效率高(~95%)且能夠產生活性更高的mRNA
  • 產生天然Cap 1結構，減少對宿主先天免疫系統的刺激
  • 使用“One pot”共轉錄反應產生cap 1結構，相比酵素法Cap純化步驟減少


Reporter Gene mRNA

CleanCap® EGFP mRNA (5moU) Cat #: L-7201
CleanCap® FLuc mRNA (5moU) Cat #: L-7202
CleanCap® mCherry mRNA (5moU) Cat #: L-7203
CleanCap® Renilla Luc mRNA (5moU) Cat #: L-7204
CleanCap® beta gal mRNA (5moU) Cat #: L-7208
CleanCap® EGFP mRNA Cat #: L-7601
CleanCap® FLuc mRNA Cat #: L-7602
CleanCap® beta gal mRNA Cat #: L-7608


Genome Editing mRNA

CleanCap® Cas9 mRNA (5moU) Cat #: L-7206
CleanCap® Cas9 Nickase mRNA (5moU) Cat #: L-7207
CleanCap® Cre mRNA (5moU) Cat #: L-7211
CleanCap® Cas9 Mrna Cat #: L-7606


Gene Replacement mRNA

CleanCap® EPO mRNA (5moU) Cat #: L-7209


Antigen mRNA

CleanCap® OVA mRNA (5moU) Cat #: L-7210
CleanCap® OVA mRNA Cat #: L-7610